PLÁSMIDO Ti DE AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
Agrobacterium tumefaciens es una alfa-proteobacteria Gram negativa, de la familia Rhizobiceae, que provoca tumores por transformación en células vegetales; lo que se conoce como la enfermedad de la agalla. Normalmente los tumores se forman en la parte baja del tallo, sobre todo en plantas dicotiledóneas. La capacidad infectiva de la bacteria se debe al plásmido Ti (tumor inducing), siendo completamente avirulentas las cepas que carecen del plásmido.

PLÁSMIDO Ti
El plásmido Ti es replicativo, de doble cadena, circular y de gran tamaño; que oscila mucho de unas cepas a otras, pudiendo llegar a las 300Kb. Su tamaño medio es cercano a las 200 kb. En él se encuentran genes de virulencia, de síntesis y catabolismo de opinas (como octopina o nopalina) y de síntesis de fitohormonas.
La región del plásmido que se transfiere a la a la célula huésped, se denomina t-DNA. En ella, se encuentran genes para la síntesis de una o varias auxinas, de una o varias citoquininas y de opinas. Las auxinas y citoquininas son las responsables de la formación del tumor, por proliferación y crecimiento exacerbados de las células vegetales. Las opinas son derivados de aminoácidos, que sirven de principal de nutriente de Agrobacterium tumefaciens, sirviéndole a la bacteria de fuente de energía, por oxidación aerobia. La región t-DNA, se encuentra flaqueada por dos secuencias constituidas por repeticiones directas de 23 nucleótidos, en alguna ocasión 25), que delimitan que zona del plásmido se va a movilizar. Estas secuencias se denominan borde derecho e izquierdo del t-DNA. Todo lo ubicado entre ambas, pasará a la célula vegetal.
Los genes de virulencia son los encargados de transferir y proteger el t-DNA. Se encuentran como un operón.
En la región que no se transfiere quedan los genes para el catabolismo de opinas.
Como todo plásmido, para poder permanecer en la bacteria sin perderse, porta el origen de replicación de Agrobacterium tumefaciens.

En conclusión, la función del plásmido es convertir a la planta en una factoría productora de opinas, para satisfacer los requerimientos energéticos de la bacteria.

MECANISMO DE INFECCIÓN:
Agrobacterium tumefaciens capta señales de tipo fenólico, por el receptor traducido a partir del gen de virulencia virA; lo que le indica a la bacteria que se encuentra frente a una planta susceptible a la transformación.
Vir A presenta actividad serín-kinasa y al unirse a su ligando, fosforila, con gasto de ATP a Vir G. Una vez fosforilado, Vir G actúa como factor de transcripción para el resto de genes de virulencia. Por acción conjunta de Vir D1 y Vir D2 se escinde el t-DNA del resto del plásmido de en la hebra que va de 5´ a 3´. Simultáneamente, se transcribe una zona complementaria a la que se separa del plásmido. Vir D2 se coloca en el extremo derecho del t-DNA. El t-DNA sale de la bacteria a través de un poro formado por Vir B. Mientras va saliendo, Vir D4 incorpora un complejo formado por Vir E1 y Vir E2, a lo largo del t-DNA. El complejo formando por Vir D2, VirE1-Vir E2 y t-DNA, entra en la célula vegetal, a través de un mecanismo poco conocido, y acompañado por VirF.

En el citoplasma vegetal, Vir E2 interacciona con VIP 1 y VIP2, lo que permite la unión de Vir F al complejo. Vir D2 presenta una secuencia NLS (secuencia de direccionamiento al núcleo), la cual es reconocida por importinas citoplasmática, que dirigen al complejo al nucleoporo. El nucleoporo formado por distintas proteínas Nup, que permiten el paso del complejo, gracias a que la importina establece uniones transitorias con las secuencias FG de las proteínas Nup. Una vez en el núcleo Ran cambia su unión a GDP por GTP para inducir la liberación de la importina y su liberación al citoplasma. Una vez que el t-DNA se encuentra en el núcleo, se integra en dentro del genoma vegetal. La integración no es al azar. Existen zonas de integración preferencial.

Cada célula vegetal infectada, incorpora de una a cuatro regiones de t-DNA de distintas bacterias. El t-DNA se mantiene estable une vez integrado en el cromosoma vegetal.

APLICACIONES DEL PLÁSMIDO Ti
El plásmido Ti ha sido el principal impulsor de la ingeniería genética en plantas. Gracias a su empleó se ha conseguido multitud de variedades transgénicas. Continuamente, se han realizado modificaciones en el plásmido Ti con objeto de mejorar sus características como vector. Habitualmente se añade uno o más genes resistencia a antibióticos, y se elimina el T-DNA no esencial, y los genes que codifican el desarrollo del tumor. Se mantienen genes necesarios para la infección de la célula vegetal. También se ha insertado el T-DNA en el plásmido pBR32 de Escherichia coli y en otros plásmidos para producir vectores de clonación capaces de desplazarse entre bacterias y plantas. El gen o los genes de interés se empalman en el t-DNA entre las repeticiones directas, mediante empleo de enzimas de restricción y ligasas. A continuación, se introduce el plásmido en Agrobacterium tumefaciens, se seleccionan por resistencia a antibióticos las bacterias que incorporan el plásmido, y se infectan con la bacteria células en cultivo de la planta a transformar. La bacteria se elimina empleando una mezcla de antibióticos y se seleccionan los transformantes en función de su resistencia a antibióticos o herbicidas (u otro rasgo codificado por el t-DNA). Finalmente, se regeneran plantas completas a partir de las células en cultivo, mediante la utilización de auxinas y citoquininas que estimulan la producción de callos y brote. El motivo de eliminar el t-DNA no necesario, es porque las fitohormonas para las que codifica, pueden interferir en la regeneración de plantas.

Otra técnica consiste en emplear un sistema binario con dos plásmidos. Uno de los plásmido porta las secuencias necesarias para la integración al genoma se encuentran en los bordes del T-DNA, pudiendo ser reemplazado el resto de la secuencia del T-DNA. El otro plásmido. Denominado Helper, porta los genes de virulencia (vir) responsables de la transferencia del T-DNA, actúan en trans, por lo que no tienen que estar situados en el mismo plásmido que el T-DNA, por lo que no es oncogénico pero es capaz de transferir el T-DNA presente en otro plásmido.

Un plásmido vector que contiene los bordes del T-DNA. Este plásmido es pequeño y de fácil manipulación en E. coli para el clonado de secuencias. No presenta los genes para la producción de fitohormonas ni opinas. Presenta sitios de restricción múltiples dentro de los bordes del T-DNA para el clonado de secuencias. Contiene también un marcador para la selección de las células transformadas, como por ejemplo, resistencia a kanamicina, herbicida o marcador metabólico.

Independientemente de emplear uno o dos plásmidos, se suelen construir genes en tándem con la información deseada, precedidos de un promotor. Fraley y col, en 1993, trabajando para Monsanto, usaron como marcadores genes que otorgaban resistencias a determinadas sustancias. Estos genes se introducían en el ADN-T, junto con los genes deseados para la planta transgénica. Así, podían ver cuales eran las células transformadas. Destacan los genes de resistencia a kanamicina, carbenicilina y a higromicina. Las células vegetales que sobrevivían al ataque de estas sustancias, eran en las que se confirmaba una transformación.

Uno de los marcadores más usados hoy en día, es el gen β-glucuronidasa (GUS). Se extrae de Escherichia coli. Dicho gen codifica para una enzima que, al degradar un galactósido, aporta pigmentación azul. Las células que experimenten el cambio de color, serán las transformadas.
Otro ejemplo de marcador que induce cambios de color, es la proteína fluorescente verde. Se obtiene de la medusa Aequorea victoria. Esta proteína se codifica en presencia de oxígeno, lo que hace bastante sencilla la identificación de los vegetales transformados.

El uso de discos foliares se volvería un método estandarizado. Fue diseñado en 1985, por Horsch, para la compañía Monsanto. Consiste en introducir discos de hojas de tabaco en un cultivo con Agrobacterium tumefaciens en un medio LB (caldo Luria Bertoni). Se agita para asegurar la infección. Después los discos se colocan en medios de cultivo que sustancias que estimulan la aparición de brotes. Luego se exponen los discos a un medio selectivo, para eliminar las plantas no transformadas.

De todos modos, no se puede afirmar al 100% que todas las plantas resistentes, han sido transformadas. Cabe la posibilidad de que la planta ya fuese resistente per se al agente elegido como marcador. Las pruebas genéticas serán las encargadas de desvelar cuales de las plantas resistentes son realmente transgénicas. Para confirmarlo, se emplean Southern, Northern y Western. Así se confirma que hay ADN, ARN y proteína, producto de la inserción. El uso de GUS como marcador, si garantiza que los discos que tornan su coloración a azul, son realmente transgénicas.


PROMOTORES
Se encargan de asegurar la expresión del transgén. Se suelen extraer de virus, porque presentan una capacidad de expresión, debida a la naturaleza infectiva. Los del virus del mosaico de la coliflor son los más usados, cabe destacar el promotor 35S, el cual es usado por Monsanto. Esto permite al transgén ser transcrito con prioridad ante el genoma celular; puede expresarse hasta 1000 veces consecutivas. El promotor, también indica el lugar de incorporación del gen en el genoma vegetal. Toda la secuencia de ADN introducido se denomina casete de expresión, que se constituye de: Gen deseado
Promotor
ADN-T
Gen marcador

El promotor provoca una situación de estrés en la planta, ante el intento de ésta para contrarrestar el efecto que tiene sobre ella.

Los resultados han sido excelentes en dicotiledóneas, pero en monocotiledóneas, la infección no es tan efectiva. Ello ha llevado a diseñar nuevos métodos para integrar el t-DNA en las células vegetales.
No obstante, la infección por Agrobacterium tumefaciens suele ser el método más eficaz, además de presentar patrones de herencia mendeliana y dar un alto porcentaje de plantas regeneradas fértiles.

BIOLÍSTICA
Su nombre significa balística biológica. Consiste en un método de transferencia directa, que es llevado a cabo por el bombardeo de microproyectiles. Fue introducido por Sanford en 1987. Se usan partículas pesadas, tales como oro o tungsteno, con diámetro de una micra, recubiertas de ADN. Estas partículas se disparan hacía las células vegetales.
En 1988, Klein usó para acelerar partículas de tungsteno un mecanismo que funcionaba con pólvora. Pero acarreaba daños celulares severos por la toxicidad del tungsteno, por contaminación acústica y por el impacto mecánico. La técnica ha sido perfeccionada por Russel, usando partículas de oro y un acelerador a base de helio.

Las ventajas del uso de biolística radican en:
Facilidad de uso
Alta velocidad. Hasta doce plásmidos integrados por disparo.
Los genes que recubren la partícula recuperan su actividad biológica
Se puede aplicar a cualquier tejido de la planta
Es capaz de alcanzar capas de células profundas

Como problemas se pueden mencionar:
El porcentaje de éxito no es total y se pueden requerir varios intentos.
Las partículas deben alcanzar células competentes, que por lo general son escasas, con la excepción de tejidos embrionarios.
En cereales es complicada su aplicación.
Es frecuente el insertado de varias copias del transgén, lo que supone un inconveniente a la trabajar con las plantas.
Muchas veces no se consigue una introducción estable.

Otra aplicación de esta técnica es el producir daños mecánicos, disparando proyectiles sin ADN, para luego usar Agrobacterium tumefaciens como vector de transmisión génica.

VECTORES VIRALES
Se ha usado como vector, el virus del mosaico de la coliflor, el virus del mosaico del tabaco y otros virus ARN. Una técnica denominada ragroinfección consiste en introducir ADN vírico en el ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, para provocar una infección sistémica y obtener así plantas transgénicas.

Como ventajas, se pueden citar:
Facilidad de infección.
Afecta a un mayor número de hospedadores que Agrobacterium tumefaciens.

Como desventajas, aparecen:
Desarrollo de la enfermedad, la cual puede llegar a ser letal.
Alto número de errores en la secuencia del gen introducido.
No se suele transmitir a la descendencia, ya que para la transformación no es necesario el engarzado del gen dentro del genoma de la planta.

TRANSFERENCIA DIRECTA
Se introduce el ADN en el protoplasto, haciéndole precipitar con fosfato cálcico, se realiza una electroporación o se elabora un tratamiento con polietilenglicol (PEG). Se usa cuando las demás técnicas no ofrecen resultados positivos. Para fusionar protoplastos se utiliza polietilenglicol. Con esto se consiguen híbridos interespecíficos.
Otro método, es el de fusionar liposomas a la célula o tejido que se quiere transformar. Se trabaja con Lipofectina, que es un compuesto comercial estable, a diferencia de los liposomas naturales. Los liposomas descargan ADN al medio intracelular, con la ventaja de tener una membrana que protege al ADN. Su eficacia aumenta al tratarlo con polietilenglicol o por electroporación. Los resultados no han sido los esperados.

MICROINYECCIÓN
Destaca por ser de las técnicas más precisas para incorporar ADN en compartimentos celulares. Se realiza mediante dispositivos microcapilares en conjunto a microscopía, para introducir el ADN sin causar daños.

Las ventajas a destacar son:
Se puede decidir la célula a transformar.
Control visual
Aplicable a pequeñas estructuras (microsporas y zigotos).
Al introducirlo en el núcleo, no se expone a agresiones propias del citoplasma (como degradación por DNAasas).

Desventajas:
Es un proceso lento, en el que se tiene que aplicar el método célula a célula.
Requiere mayor habilidad e instrumental más complejo.

EXPRESIÓN
Las plantas que se transforman tendrán comúnmente diferentes niveles de expresión. Un fenómeno que no siempre se correlaciona con el número de copias. La expresión diferencial de los transgenes ha sido atribuida a efectos posicionales, donde la posición del sitio de integración del ADN-T en el genoma receptor afecta el nivel de expresión del transgén.

El ADN-T se puede integrar en el genoma receptor en patrones alternativos al de copia única en un único sitio. También pueden ocurrir múltiples copias o repeticiones invertidas y otros patrones complejos. La presencia de insertos de ADN-T multiméricos, especialmente estructuras repetidas invertidas, se correlaciona fuertemente con el fenómeno de silenciamiento del transgén.La expresión variable de los transgenes o el silenciamiento génico es un fenómeno ubicuo en las plantas transgénicas. El silenciamiento génico puede ser el resultado de las interacciones entre las múltiples copias del transgén y genes endógenos relacionados, y está asociado con mecanismos basados en homología de secuencia que actúan tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional. El silenciamiento que es resultado del impedimento de la iniciación de la transcripción está usualmente asociado a la metilación de las citosinas o a la condensación de la cromatina, mientras que el silenciamiento post-transcripcional involucra una incrementada degradación del ARN en el citoplasma.
Además, el ADN vegetal flanqueante y/o la localización cromosómica desfavorable ejercen, en ocasiones, un efecto de silenciamiento sobre el transgén.